非供体来源肝细胞的获得及其促进肝脏再生的研究进展
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编辑│陈圆圆 ┃ 审校│汤红明
何志颖
同济大学附属东方医院特聘研究员/博士生导师、再生医学研究所副所长、同济大学东方临床医学院生物技术教研室主任。获上海市浦江人才、军队优秀专业技术人才称号。长期从事肝细胞移植的基础和应用研究，在非供体肝细胞来源获得、干细胞肝向分化、肝细胞移植与功能评价、肝细胞衰老及肝癌发生机制等研究方面取得系列成果，在Nature、Cell Stem Cell、Gastroenterology、Hepatology等国际学术刊物上发表论文60余篇。获得国家“973计划”课题、上海市科委重大项目、国家自然科学基金等18项基金资助。
肝移植是目前治疗终末期肝病的唯一有效方法，但供肝匮乏严重制约其在临床上的广泛应用。肝细胞移植作为原位肝移植的替代疗法，虽已取得令人振奋的进展，但肝细胞来源也同样面临供体不足的尴尬，因此探索充足的非供体来源的肝细胞具有十分重要的意义。
近年来，干细胞与再生医学的迅速发展为终末期肝病的治疗带来新的希望。研究表明多种干细胞来源的肝细胞具有参与肝损伤修复和促进肝再生的能力。如图描述了多种获得非供体来源肝细胞的策略。笔者将着重介绍不同策略获得非供体来源肝细胞的优缺点，并探讨肝再生细胞治疗的安全性。
图 获得非供体来源肝细胞的策略
一、非供体来源肝细胞的获得策略
1. 胚胎干细胞分化为肝细胞
胚胎干细胞（ESCs）具有自我更新的能力和分化为各种细胞类型的多能性，是实现非供体肝细胞来源的重要方案。ESCs可分化为具有肝细胞特性的功能性肝细胞。多项研究已经报道，ESCs诱导分化的肝细胞移植到肝衰竭小鼠模型后可有效增殖并修复受损肝脏。虽然有潜在的临床应用价值，但应用人ESCs来源的肝细胞存在较多争议：应用ESCs存在破坏人胚胎生命的伦理争议；存在免疫排斥反应；分化不完全时也存在着致瘤风险。
2. 诱导多能干细胞分化的肝细胞
获得诱导多能干细胞（iPSCs）不需要破坏人胚胎，而且每个人的成体细胞都能诱导出他们自身特异性的iPSCs。因此，iPSCs的应用规避了伦理学和免疫排斥问题。利用iPSCs诱导分化的肝细胞除了具有肝细胞的基本特征外（如肝细胞特异性标志物、CYP系列酶等），还保留了原始细胞供者的遗传基因背景。
iPSCs是一种很有前景的获得非供体肝细胞的干细胞来源，但在应用中也存在一些问题需要解决。例如，iPSCs在分化为功能细胞的过程中，DNA甲基化和基因突变的概率以及拷贝数的变异均有增加，因而iPSC的应用安全性受到质疑。其次，与ESCs的研究一样，如何高效地将iPSCs诱导分化为肝细胞仍然是一个难点，且iPSC仍然存在致畸胎瘤的风险。
3. 肝干细胞分化的肝细胞
研究认为，成体肝脏内存在肝干细胞（LSCs）或肝前体细胞，它们可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞，是参与肝损伤后肝脏修复的重要细胞来源。靠近导管周围腺体和肝外胆管中Hering管的卵圆形细胞被认为是一种LSCs。LSCs具有异质性，部分细胞表达胆管上皮细胞特异性标志物如CK19和OV6，部分表达干细胞标志物如Sox9、C-kit和Epcam等。在某些慢性肝损伤过程中，机体固有的LSCs被激活，发生象征肝再生的胆管反应，参与肝脏的再生修复，是参与肝损伤后肝脏修复的重要细胞来源。
然而，最近的研究表明LSCs可能只在肝脏内稳态和肝再生中起很小的作用。肝再生中的新生肝细胞来源于肝脏中的肝细胞而非卵圆细胞。这表明在生理状态及急性肝损伤情况下，肝脏的修复主要是通过肝细胞进行的。
4. 谱系重编程获得肝细胞或肝干细胞
谱系重编程是利用谱系特异性转录因子或小分子化合物，诱导细胞从一种分化状态直接转分化为另一种状态，从而在谱系内和/或谱系间实现细胞类型的转换。
例如，在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达转录因子Foxa3、Gata4和Hnf1α，可以诱导其转分化为具有肝细胞功能的诱导性肝细胞（iHeps）。在人成纤维细胞中过表达Hnf4α、Hnf1α和Foxa3，同样可获得具有成熟肝细胞功能的人iHeps。成熟肝细胞不能在体外扩增，无法通过培养获得充足的细胞数量。通过转染Hnf1β和Foxa3可将小鼠成纤维细胞中谱系重编程为诱导型肝干细胞（iHepSCs）。iHepSCs可以大量扩增，能为临床上的肝细胞移植提供充足数量的供体肝细胞。
谱系重编程不仅解决了肝细胞来源的问题，也避免了ESCs/iPSCs应用中的伦理问题、免疫排斥及致瘤风险。因此，通过其获得肝细胞或肝干细胞是获得非供体肝细胞来源的一种很有前景的方案。
5. 造血干细胞分化的肝细胞
当肝脏受损时，造血干细胞（HSCs）可被动员进入外周血循环。有报道指出，移植的HSCs能在肝损伤动物模型中修复受损肝脏， HSCs可作为非供体肝细胞的来源。然而，关于HSCs转分化为肝细胞的潜力仍存争议。有研究指出，HSCs移植后产生的功能性肝细胞不是由HSCs分化而来，而是由HSCs与宿主肝细胞的融合产生。
6. 间充质干细胞对肝再生的作用
大量研究表明间充质干细胞（MSCs）移植对肝纤维化、肝硬化等有较好的治疗作用。目前已开展人MSCs进行肝硬化治疗的临床研究，患者移植MSCs后其肝脏中胶原沉积减少，肝功能改善。与肝细胞移植相比， MSCs移植主要有以下优点：MSCs可以从多种组织获取，因此制备和扩增相对容易；MSCs可以取自于自体组织，免疫和致瘤风险较低；MSCs本身也具有较低的固有免疫原性。这些特性提高了MSCs应用的安全性，使MSCs成为肝病治疗的极有临床转化前景的细胞来源。
然而，关于MSCs在肝再生中的作用学界观点并不一致。一些研究认为MSCs分化为肝细胞是疗效的关键。MSCs移植后能分化为肝细胞从而改善急慢性肝衰竭动物的肝功能。MSCs和原代肝细胞共培养可以诱导MSCs分化成肝细胞，移植后能减轻宿主的肝纤维化。但是，近年来大量研究指出MSCs是作为免疫抑制剂发挥作用。肝脏是一个免疫复杂的器官，炎症是不同肝病的最典型特征之一。研究表明MSCs可以通过刺激免疫细胞来调节细胞因子分泌，从而调节固有免疫和适应性免疫应答。例如，MSCs来源的IL-6和HGF可抑制单核细胞向树突状细胞转化从而抑制炎症反应。
虽然MSCs移植的安全性已得到证实，但是长期培养可能导致MSCs的基因组发生突变和转分化，已有研究表明小鼠MSCs可通过转分化刺激肿瘤生长，需要在临床转化研究中引起高度重视。
二、肝细胞移植治疗的展望
从干细胞角度探讨肝脏的发育机制及肝损伤修复的原理与技术是肝脏再生医学研究的重点方向，将为终末期肝病、遗传代谢性肝病等临床治疗提供广阔的应用前景。虽然不同来源干细胞向肝细胞分化及再生肝脏的研究，从基础理论到临床应用还有诸多关键技术问题和理论没有解决，但可以应用的方向已经逐渐明确：
（1）辅助性肝细胞移植。以自体或同种异体干细胞诱导分化的肝细胞为基础，为急、慢性肝功能衰竭的患者提供暂时性辅助肝功能支持治疗，使这些患者渡过危险期而无需肝移植或为等待肝移植的终末期肝病患者提供暂时性肝功能支持，从而赢得肝移植的机会。
（2）治疗性肝细胞移植。在控制原发性疾病的前提下，对肝纤维化或肝硬化等患者，通过肝细胞移植替换病变肝细胞从而改善肝脏功能。对于遗传代谢性肝病、血友病等，通过肝细胞移植可纠正遗传缺陷从而纠正代谢性缺陷，这一方案将最终取代肝移植而成为此类患者的首选治疗方案。
（3）生物人工肝。应用自体或异体干细胞来源的肝细胞与生物材料结合，组装成体外生物人工肝装置，用于肝衰竭患者的辅助治疗，也可用于“肝化脾”和腹腔内肝组织结构的重建，为肝病患者提供“第二肝脏”。 随着干细胞与肝脏再生研究的迅猛发展，可望为肝病治疗带来新的春天。
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